甲型流感病毒各亚型假病毒系统的构建及H1亚型特

  【摘要】:甲型流感病毒可惹起年度时节性流感和重复的流感大年夜风行,严重伤害人平易近安康。最近几年来甲型H1N1流感的风行和人感染H5N1禽流感病毒病例不时添加,进一步提醒增强甲型流感病毒的研究和防控的主要性。血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是甲型流感病毒编码的外表糖蛋白。依据HA和NA的抗原性,甲型流感病毒可分为16个HA亚型(H1~H16)和9个NA亚型(N1-N9)。HA和NA的重组和重配发生新的病毒是形成流感大年夜风行的主要启事。实际上16个HA和9个NA亚型可自在组合构成144种亚型流感病毒,少数亚型流感病毒已在天然界被发明,但激发大年夜风行的流感病毒的亚型种类仍没法猜测。因此,增强亚型特异性快速诊断、增强监测才华和时发明风行的流感亚型的变更是应对流感大年夜风行主要基础。为此,本研究构建了涵盖各亚型流感假病毒系统,为流感病毒中和抗体的快速检测判定和深化研究HA和NA的功用供给资料和手腕;另外一方面,经过建立基于表位的甲型流感病毒亚型特异性检测技巧为开展新型的流感病毒亚型检测、监测技巧供给基础和依据。

  1、甲型流感病毒各亚型假病毒系统的构建

  构建了16个HA亚型(H1~H16)的真核表达质粒,用响应的亚型特异性抗体对HA的表达停止了免疫印迹验证,结果标明一切16个亚型HA均取得表达。对除H5和H7外的14个亚型HA的切割位点停止了改革,将切割位点由单碱性氨基酸突变成多碱性氨基酸,免疫印迹结果标明切割位点改革不影响HA的表达,个中H1、H6、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16HA经改革后爆发切割,H2、H3、H4和H8HA改革后仍未切割。同时,构建了9个亚型NA (N1~N9)的真核表达质粒,用亚型特异性抗体(N3~N9)停止免疫印迹检考验证了响应NA的表达,并用商品化的神经氨酸酶检测试剂盒对细胞裂解液的酶活性停止了检测,结果标明9个NA的裂解液中具有很强的神经氨酸酶活性,直接证清晰明了9个NA亚型的准确表达。

  将16个HA亚型和9个NA亚型组合包装假病毒,144种假病毒感染293T细胞的结果依据HA的切割状况及与分歧NA组合的感染才华可分为四组。H5、H6、H7和H94个HA亚型均切割表达且与9个NA构成的假病毒均能感染细胞;H1、H10~H168个HA亚型能切割表达但只要与局部NA构成的假病毒具有感染性;H2和H8两个HA亚型不切割但与局部NA构成的假病毒具有感染性;H3和H4两个HA亚型不切割且与一切NA构成的假病毒都不能感染细胞。这些结果提醒分歧亚型HA在切割性和假病毒感染性上存在很大年夜差异,HA和NA在假病毒水平上存在相互感化的能够,其具体机制还需求进一步的研究。胰酶处理增强了本来不能感染的H3和H4假病毒的感染性。我们关于构建的假病毒经过以下三种方法停止了验证,电镜下能不美观察到完整的病毒粒子形状,免疫印迹结果标明HA均掺入响应的假病毒,血凝试验标明掺入假病毒的HA具有生物学活性。最后,用H1、H3、H5和H7假病毒与响应抗体停止了假病毒中和试验,结果标明H1、H3、H5、H7(?)病毒可被响应抗体中和,初步说明我们所构建的假病毒可用于中和抗体的检测和评价。

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